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La serie comienza con Peter Parker a la edad de 15 años. E s un chico bastante tímido pero inteligente que que vive en Queens, en Nueva York, con su Tio Ben y su Tia May. Estudia en el instituto y mientras realiza una visita escolar a las Industrias Osborn, es picado por una araña modificada genéticamente.

Como en el universo Marvel tradicional, Peter adquiere las habilidades de una araña como la fuerza, la agilidad y los reflejos incrementados, la habilidad para escalar paredes y su famoso sentido arácnido que le previene del peligro.

Peter descubre su talento para la lucha tras una pelea en el instituto con Flash Thomson, en la que es capaz de parar un puñetazo rompiendo la mano del matón del instituto.

Al principio Él utiliza sus poderes para ganar dinero en concursos de Lucha Libre, con el fin de pagar las facturas médicas y utilizando un disfraz que le proporciona el organizador del concurso. Pero al darse cuenta que el ladrón que dejo escapar era el que se asesinó a su Tio Ben, Peter se siente culpable y toma la responsabilidad de proteger a la ciudad como el héroe enmascarado Spiderman.

Para ello el decide hacerle modificaciones a su traje de lucha,  y termina las fórmulas de su padre para poder crear adesivos especiales, creando así su disparador de telarañas.

Como el Peter Parker original, intenta mantener en equilibrio sus estudios en el instituto, su trabajo como diseñador web en el periódico, cuidar de la Tía May y su vida como Spiderman. La mayor diferencia está en que Reed Richards afirma que puede curar a Peter, dándole la opción de poder dejar de ser Spiderman en algún momento.

Elenco de Ultimate Spiderman:

• Tía May: Es un pilar de apoyo para Peter. Es una mujer independiente de unos cincuenta años, que trabaja como secretaria y que regularmente ve a una terapeauta para poder lidiar con la muerte de su esposo Ben. May odia a Spiderman debido a que  piensa que no tiene piedad por la gente inocente y debido a que  oculta su rostro con una máscara, piensa que tiene algo que esconder. En el número 99 descubre la identidad secreta de Peter lo que la hace enfadar pero después de un tiempo acaba aceptándolo.
• Tío Ben: Es un hombre amable y generoso que le dice a Peter la famosa frase de: Un gran poder conlleva una gran responsabilidad. Acaba siendo asesinado por un ladrón al que Peter se niega a detener.
• Mary Jane Watson: Es la vecina de Peter además de su novia y es la primera persona a la que le confiesa su identidad secreta. Ella le ayuda remendando sus trajes y curando sus heridas de batalla. Es una brillante estudiante y está enamorada de Peter sintiendo celos de Gwen Stacy o Kitty Pryde. Fue secuestrada por el Duende Verde, Pero Spiderman logró rescatarla.
• Harry Osborn: Es el problemático hijo de Norman Osborn y presenció el accidente que convirtió a su padre en el Duende Verde. Perturbado por las imágenes de su pasado, Harry crea a Shaw como una segunda personalidad que le sirve como guía para crear al Hobgoblin. Como él,  sus poderes son muy parecidos a los del Duende Verde con la diferencia de que posee una mejor defensa y un factor curativo. Finalmente es asesinado a manos de su padre.
• J. Jonah Jameson: Es el editor jefe del Daily Bugle y como es normal, odia a Spiderman y se encarga de desprestigiarlo desde su periódico. Sus mejores empleados son Robbie Robertson y Ben Urich, además de su secretaria, Betty Brant.
• Gwen Stacy: Es una chica del barrio que hace amistad con Peter y Mary Jane, cuyo padre es George Stacy, el capitán de la policía de Nueva York.  Éste es asesinado por un impostor disfrazado de Spiderman por lo que su hija culpa al verdadero Spiderman por su muerte. Debido a que su madre se niega a cuidar de ella, la Tia May decide a darle un techo en su casa. Mientras vive con los Parker, es asesinada por Matanza para aparecer posteriormente revelándose ser la nueva encarnación de Matanza además de un clon de la original. Venom reabsorbe a Matanza y Tony Stark examina el cuerpo de Gwen, afrimando que es una copia molecular exacta de la auténtica Gwenm, es decir, es como si hubiera vuelto a la vida.
• Liz Allan: Es la mejor amiga de Mary Jane y padece de fobia a los mutantes. Recientemente se ha revelado que ella misma es una mutante y se hace llamar Estrella de Fuego.
• Kitty Pryde: Es una mutante miembro de los X-men que cambia de Instituto para Jóvenes Talentos tras la muerte de Charles Xavier. En el nuevo instituto conoce a Peter Parker y empieza una relación sentimental con él después de que  rompa con Mary Jane. Kitty usa un disfraz de color verde y amarillo cuando pelea al lado de Spiderman para evitar revelar su identidad. La relación de ella con Peter es difícil debido a que ambos se mantienen alejados uno del otro, ya que Kitty sabe que la chica de la que realmente está namorado es Mary Jane.
• La Gata Negra: Felicia Hardy culpa a Kingpin de la muerte de su padre y como venganza le roba un artefacto, teniéndoselas que ver con la asesina a sueldo Elektra. Tras salvar a Spiderman de un disparo, se encapricha con él, llegando a besarlo a través de la máscara y desconociendo la diferencia de edad que hay entre ambos. Cuando le quita la máscara y descubre al adolescente tras ella, lo rechaza y vomita sobre su propio traje. Esta versión de Felicia es morena y lleva el pelo corto, usando una peluca blanca como parte de su disfraz.
• Dr. Curt Conners: Es un profesor de la Universidad Empire State quien intenta hacer crecer de nuevo el brazo que perdió en Vietnam. Para ello utiliza ADN de lagarto sufriendo como efecto secundario la transformación en el Lagarto, algo menos inteligente que el original y con un aspecto más anfibiesco. Además, accidentalmente, a partir de la sangre de Peter infectada con el traje de Venom, crea al supervillano homicida Matanza. Debido a las muertes que causa, Conners es arrestado e Industrias Stark cancela el soporte financiero de sus experimentos.
• Spiderwoman: Mientras Peter investigaba la desaparición de Mary Jane, se encuentra con una mujer enmascarada que le noquea y que es capaz de disparar telarañas orgánicas desde sus dedos. En otra ocasión tras rescatarlo, se presenta como Jessica Drew, una clon femenina de él.
• Richard Parker: Es el padre fallecido de Peter. Formaba parte junto con Edward Brock Sr. del proyecto para crear el traje de Venom. Tras desentenderse del proyecto sufre un accidente de avión con su esposa y ambos fallecen. Recientemente, Richard ha reaparecido afirmando que no murió, sino que estuvo trabajando para la CIA con Nick furia. Un análisis de ADN llevado a cabo por Susan Storm, revela que no es más que un clon envejecido de Peter. Este envejecimiento acelerado le lleva a la muerte.
• Morbius: Esta versión ultimate es un vampiro de verdad, hijo de Drácula, y tiene los poderes y debilidades típicos de los vampiros. Sin embargo, morbius lucha contra sus instintos y es de hecho, un cazador de Vampiros. Conoce a Spiderman cuando intenta curar a Ben Urich de la mordedura que ha sufrido por parte de otro vampiro cuando intentaba entrevistarlo.